Covid-19 et perte d’odorat : du nouveau sur la persistance du SARS-CoV-2 et son potentiel neuro-invasif | Réalités Biomédicales

Le bulbe olfactif constitue le premier relais nerveux du système olfactif. Cette structure, située sous le cerveau, reçoit les axones des neurones de l’épithélium olfactif qui traversent le toit des fosses nasales. © Wikipedia

Le SARS-CoV-2 peut persister au sein de l’épithélium olfactif, non seulement pendant plusieurs semaines à la suite de la Covid-19, mais également pendant des mois après la disparition des symptômes, indique une étude française postée le 18 novembre 2020 sur le site de prépublication bioRxiv. Les données de ces travaux semblent également indiquer que le coronavirus pourrait pénétrer dans le système nerveux central en cheminant, par voie rétrograde, à partir des voies nerveuses olfactives.

Obtenues chez des patients Covid-19 et sur le hamster syrien doré, modèle animal de l’infection par le coronavirus, ces nouvelles données fournissent un mécanisme pouvant expliquer la persistance ou la rechute de la perte totale ou partielle d’odorat (anosmie) chez des patients Covid-19. Ces résultats soulèvent également de nouvelles interrogations sur la possibilité que le SARS-CoV-2 puisse atteindre le système nerveux central (cerveau, tronc cérébral) par voie rétrograde, en remontant donc le long des filets nerveux du système olfactif.

La présence du virus a été attestée après examen des cellules de l’épithélium olfactif. Le prélèvement a consisté, à l’aide d’une brosse cytologique et sous guidage endoscopique, à effectuer des mouvements de rotation et de translation au niveau des cornets des fosses nasales, le plus souvent le cornet inférieur, afin de ramener un prélèvement riche en cellules. On rappelle que les cornets sont des petites lamelles osseuses situées dans la paroi latérale de la cavité nasale.

Brossage nasal

Le brossage nasal effectué chez des patients atteints d’une perte récente d’odorat, de même qu’auprès de personnes se plaignant d’une anosmie prolongée ou d’une rechute de celle-ci, a permis d’observer la présence du SARS-CoV-2 dans le prélèvement. Et ce alors même que ce même virus n’était pas détecté par la technique RT-PCR sur les écouvillonnages nasopharyngés. Ceci montre que le diagnostic de l’infection de la muqueuse nasale par le SARS-CoV-2 via un brossage nasal est plus performant que celui effectué après le désormais classique prélèvement nasopharyngé par simple écouvillonnage, au moins chez les patients présentant une perte d’odorat.

Tout commence lorsque l’équipe de Hervé Bourhy, Marc Lecuit et Pierre-Marie Lledo des laboratoires « Lyssavirus, épidémiologie et neuropathologie », « Biologie des infections » et « Perception et mémoire » de l’Institut Pasteur (Paris), en association avec des médecins oto-rhino-laryngologistes et urgentistes (hôpitaux Lariboisière, Pitié-Salpêtrière, Paris), recrute pour leur étude cinq patients venus consulter dans un service d’ORL pour une perte d’odorat et une suspicion de Covid-19 dans le contexte de la première vague.

L’état clinique de ces patients ne nécessite pas d’hospitalisation. À l’exception d’un patient qui se plaint d’une perte progressive de l’odorat, l’anosmie des quatre autres a été de survenue soudaine. Ce symptôme prééminent s’accompagne de modifications du goût, sauf pour l’un d’eux. Selon les cas, d’autres symptômes sont présents, tels que diarrhée, toux, difficulté à respirer, conjonctivite, fièvre, fatigue, maux de tête, douleurs musculaires, laryngite ou simple mal de gorge. Chez l’un des patients, la perte de l’odorat a été le premier symptôme à apparaître. L’anosmie est sévère chez quatre des patients, modérée chez un autre. Chez ces quatre patients anosmiques, la perte de goût (agueusie) est également sévère. Celle-ci est modérée pour l’autre patient.

Quatre patients ont le nez qui coule (rhinorrhée). Deux se plaignent d’une irritation nasale. Un autre présente une hyperacousie (hypersensibilité aux sons). Aucun patient n’a le nez bouché. Quatre patients présentent par ailleurs un trouble du goût (dysgueusie) avec, selon les cas, une moindre acuité pour le sucré, un mauvais goût dans la bouche, une acuité réduite ou exagérée pour l’amer, une sensation réduite pour le salé ou l’acide. Chez deux patients, la dysgueusie est telle qu’ils ne parviennent pas à différencier la viande du poisson.

Désireux de savoir si la perte de l’odorat est liée à l’infection de la muqueuse olfactive, les chercheurs décident de prélever chez ces cinq patients des cellules par brossage nasal. Seuls deux d’entre eux ont été testés positifs pour le SARS-CoV-2 à la technique RT-PCR après écouvillonnage nasopharyngé. Les virologues vont alors détecter l’ARN viral dans le prélèvement cellulaire de la muqueuse olfactive, ce qui atteste de façon certaine de la présence d’une infection par le SARS-CoV-2. Un patient présente une charge virale élevée dans la muqueuse olfactive (2,25 millions de copies/microlitre) tandis qu’elle est trop faible pour être quantifiable chez les autres.

Les chercheurs entreprennent alors de rechercher, par  immunofluorescence, la présence du virus dans le prélèvement cellulaire obtenu par brossage nasal à la recherche de protéines virales. Le marquage se révèle positif chez trois patients : il atteste de la présence d’un antigène du SARS-CoV-2 (nucléoprotéine NP, présente à l’intérieur des particules virales) dans des neurones sensoriels matures. Ces données montrent ainsi que l’infection à SARS-CoV-2 est associée à l’inflammation de la muqueuse olfactive de patients présentant un trouble de l’odorat.

Les scientifiques décident ensuite d’évaluer le profil de médiateurs de l’inflammation, en l’occurrence de cytokines produites localement et d’autres médiateurs de l’inflammation. Il ressort que la cytokine pro-inflammatoire interleukine 6 (IL-6) est abondamment produite chez trois patients porteurs d’antigènes du SARS-CoV-2.

À ce stade, il apparaît donc clairement que le coronavirus SARS-CoV-2 présente un tropisme particulier pour l’épithélium olfactif et que l’infection qui en résulte est associée une inflammation locale importante.

Infection de neurones sensoriels olfactifs et de leurs cellules de soutien

Mais quelles sont précisément les cellules cibles du virus à ce niveau ? Les chercheurs vont déterminer que de nombreux types cellulaires du neuroépithélium olfactif (situé dans le toit des cavités nasales et impliqué dans la perception des molécules odorantes) sont infectés lors de l’infection aiguë par le SARS-CoV-2 au moment où survient la perte de l’odorat.

Les chercheurs détectent en effet que les neurones sensoriels olfactifs matures ne sont pas les seules cellules infectées par le coronavirus. Des cellules de soutien des cellules nerveuses sensorielles (cellules sustentaculaires) et des cellules immunitaires (cellules myéloïdes) le sont également. Idem pour des neurones sensoriels encore immatures de la muqueuse nasale. Au microscope, certains de ces neurones infectés sont sur le point d’être phagocytés par des cellules appartenant à la première ligne de défense du système immunitaire (immunité innée).

Le hamster, modèle d’infection par le SARS-CoV-2

Les chercheurs décident alors de se tourner vers un modèle animal naturel de l’infection par le SARS-CoV-2, en l’occurrence le hamster syrien doré (Mesocricetus auratus) qui exprime un récepteur ACE2 capable d’interagir avec le SARS-CoV-2. On rappelle que la protéine S (Spike, spicule en français) de l’enveloppe du SARS-CoV-2 sert aux virions à se fixer sur le récepteur ACE2 présent sur les cellules cibles.

Ces rongeurs vont être inoculés par voie intranasale avec le SARS-Cov-2 et suivis pendant plusieurs jours. Les hamsters infectés vont présenter deux à quatre jours après des charges virales élevées dans les voies respiratoires, notamment au niveau des cornets. La charge virale reste détectable durant les 14 jours suivants.

ARN viral dans le cerveau de hamsters infectés

Les chercheurs rapportent un résultat surprenant : ils ont détecté la présence, dès le surlendemain de l’inoculation intranasale du SARS-CoV-2, de l’ARN du SARS-CoV-2 dans plusieurs régions du cerveau des hamsters, en l’occurrence dans le bulbe olfactif (structure ovoïde, située à la base du cerveau), mais également dans des régions du cerveau éloignées des cavités nasales, en l’occurrence dans le cortex cérébral, le tronc cérébral (diencéphale, mésencéphale, pont, moelle allongée) et le cervelet, mais sans clairement visualiser d’antigènes viraux. En d’autres termes, les chercheurs ont quantifié par PCR le matériel génétique du virus (ARN) dans le cerveau des hamsters mais pour autant détecter de protéines virales par immunofluorescence.

Anosmie et agueusie chez des hamsters infectés

Les hamsters infectés par le SARS-Cov-2 présentent également des troubles du goût. Ils ne manifestent plus une préférence marquée pour l’eau sucrée et mettent plus de temps à détecter par l’odeur des aliments cachés.

Mais qu’en est-il des dommages cellulaires provoqués par les voies aériennes respiratoires, hautes et basses, chez ces hamsters expérimentalement infectés par voie intranasale par le SARS-Cov-2 ? Chez ces rongeurs, les chercheurs vont plus particulièrement étudier la partie la plus haute des cornets, celle recouverte par le neuroépithélium olfactif composé de cellules ciliées, à savoir les neurones sensoriels et leurs cellules de soutien (sustentaculaires).

Microscope électronique à balayage montrant les changements de l’épithélium olfactif après infection par le SARS-CoV-2 chez le hamster. B’ : cellules ciliées normales. D’ : Perte de cils 2 et 4 jours après infection. D  » : particules virales bourgeonnant des cellules infectées ayant perdu leurs cils. Dias DE Mel G, et al. bioRxiv. November 18, 2020.

Il s’avère que, sur de larges portions de l’épithélium olfactif, ces deux catégories de cellules perdent leurs cils deux jours après l’inoculation du coronavirus, comme l’attestent les images obtenues en microscopie électronique. Au quatrième jour post-inoculation, on observe que des particules virales bourgeonnent à la surface de ces cellules infectées.

Coupe des cornets et du bulbe olfactif d’un hamster infecté par le SARS-CoV-2, quatre jours après inoculation du virus par voie intranasale. La zone du bas illustre un marquage de forte intensité en immunofluorescence dans les axones des neurones sensoriels olfactifs. Dias DE Mel G, et al. bioRxiv. November 18, 2020.
Quatre jours post-infection : les axones de neurones sensoriels olfactifs se projettent dans le bulbe olfactif de hamsters infectés par le SARS-CoV-2 au niveau de des structures appelées glomérules. La zone latérale (F’ et F’’) montre des cellules infectées. Dias DE Mel G, et al. bioRxiv. November 18, 2020.

Dans le même temps, au sein de la muqueuse olfactive, les chercheurs ont détecté la présence d’antigènes viraux dans le cytoplasme de neurones sensoriels matures et immatures, de même que dans des cellules immunitaires infiltrant le neuroépithélium. Ces dernières, attirées sur les lieux de l’infection virale, ont elles-mêmes été infectées après avoir phagocyté des cellules olfactives contaminées. Par ailleurs, des régions du neuroépithélium olfactif renfermant des cellules infectées apparaissent désorganisées sur le plan architectural, contrairement à des zones adjacentes indemnes d’infection qui, elles, conservent leur disposition cellulaire en plusieurs couches (aspect stratifié).

Ces cellules de la muqueuse olfactive ont retrouvé leur aspect cilié 14 jours après l’infection, en même temps que les hamsters récupéraient leur sens de l’odorat. Ces résultats montrent donc que l’anosmie est la conséquence d’une atteinte sensorielle associée à l’infection virale et non due à une simple obstruction nasale ou une inflammation tissulaire.

Surtout, les chercheurs ont constaté la présence du SARS-CoV-2 dans les filets nerveux olfactifs situés à proximité du neuroépithélium olfactif. Ils ont ainsi détecté des antigènes viraux dans les axones des neurones sensoriels olfactifs qui parviennent aux bulbes olfactifs.

Il ressort de ces travaux que l’inoculation intranasale du SARS-CoV-2 chez des hamsters entraîne une infection des neurones sensoriels olfactifs et une anosmie, reproduisant ce qu’on observe sur les plans histologique et clinique chez des patients Covid-19.

Transport axonal rétrograde

La nucléoprotéine du SARS-CoV-2 (protéine de la nucléocapside) a été détectée à la jonction entre bulbe olfactif et nerf olfactif, ce qui tend à montrer que le virus chemine de façon rétrograde, autrement dit qu’il peut « remonter » le long des axones. Cette protéine interne du coronavirus a également été détectée dans des cellules immunitaires infiltrant le bulbe olfactif.

Selon les auteurs, « l’observation de la présence d’antigènes viraux tout le long de la route qui mène de l’organe olfactif sensoriel [le neuroépithélium olfactif des cornets de la cavité nasale] au bulbe olfactif, montre que le SARS-CoV-2 entre dans le système nerveux central à travers le système olfactif » chez le hamster infecté.

Neuroinvasion et neuroinflammation chez le hamster infecté

Le SARS-CoV-2 entraîne donc, dans les bulbes olfactifs des rongeurs infectés, une intense réaction inflammatoire (surexpression de gènes impliqués dans l’inflammation) ainsi qu’une forte réponse antivirale locale (production de molécules associées à l’immunité innée et adaptative, activation de cellules immunitaires).

Les chercheurs ont utilisé un outil de biologie moléculaire sophistiqué : le « séquençage des ARN messagers sur cellules uniques » ou Single-cell RNA-sequencing (ScRNA-seq) qui permet de détecter quels gènes sont particulièrement actifs dans chacune des cellules du tissu ou de l’organe étudié. Dans la mesure où l’expression d’un gène implique que l’ADN soit converti en ARN messager (ARNm), la présence de ces molécules d’ARNm renseigne sur le fonctionnement des gènes. Cet outil a confirmé l’activité de gènes impliqués dans l’inflammation au sein du bulbe olfactif ainsi que l’activation de cellules non neuronales (astrocytes, cellules microgliales).

Selon les chercheurs, ce résultat, couplé à la présence de protéines virales dans les bulbes olfactifs qui sont des émanations du cerveau, est en faveur de « l’hypothèse selon laquelle la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 entretient la neuroinflammation ». En d’autres termes, s’il y a inflammation, c’est le signe que le virus a réussi à pénétrer dans le système nerveux central.

Et les chercheurs de préciser qu’une production accrue de molécules inflammatoires (cytokines et chimiokines) a persisté jusqu’au 14ème jour après l’infection chez ces hamsters, alors même qu’ils avaient récupéré de leur anosmie et de leur agueusie. Cela montre que, chez ces rongeurs expérimentalement infectés par le SARS-CoV-2, un processus inflammatoire peut survenir pendant l’infection symptomatique et persister durant la période post-infectieuse asymptomatique.

Anosmie prolongée/récurrente de patients Covid-19

Au vu de ces résultats obtenus chez ce modèle animal, qu’en est-il d’une possible persistance du SARS-CoV-2 chez des patients Covid-19 se plaignant de symptômes neurologiques persistants et/ou de troubles sensoriels, même trois mois après le début des symptômes ? C’est à cette importante question que se sont ensuite intéressés les chercheurs parisiens.

Pour ce faire, ils ont à nouveau recruté quatre patients Covid-19 qui présentaient soit une perte d’odorat prolongée, soit une rechute de leur anosmie. Ces personnes ont été incluses dans l’étude entre le 15 et le 29 juin 2020, à une période où le virus ne circulait que peu dans Paris. En effet, l’incidence du SARS-CoV-2 était alors inférieure à 10 pour 100 000 habitants dans la capitale. Il est donc peu probable que ces personnes aient été réinfectées par le coronavirus à ce moment-là.

Ces quatre nouveaux patients, non hospitalisés, se plaignaient d’une perte d’odorat ininterrompue (jusqu’à six mois après le début des symptômes) ainsi qu’une agueusie persistante pour trois d’entre eux. Ils présentaient également d’autres troubles neurologiques (démangeaisons nasales, douleurs intercostales gauche et dans le bras gauche, sensations de brûlures, vertige, entre autres). Deux de ces patients avaient un mauvais goût dans la bouche. Deux autres patients avaient une sensation réduite ou exagérée pour l’amer, une diminution de l’acuité gustative pour le salé ou l’acide.

Négatifs à l’écouvillonnage nasal mais positifs au brossage nasal

Aucun de ces quatre patients se plaignant d’une anosmie prolongée ou récidivante n’a alors été trouvé positif à la PCR sur prélèvement nasopharyngé. Pourtant, chez chacun d’entre eux, l’examen des cellules de la muqueuse olfactive recueillies après brossage nasal a permis de mettre en évidence la présence d’ARN du SARS-CoV-2. La détection de l’ARN viral repose sur la technique de PCR particulière dénommée RT-qPCR.*

Selon les chercheurs, la présence de l’ARN et de protéines du SARS-CoV-2 dans le neuroépithélium olfactif des fosses nasales (même si l’infectiosité du virus n’a pas pu être évaluée par culture cellulaire en laboratoire) pourrait signifier que certains patients, en particulier chez ceux présentant de légers symptômes ou n’en présentant pas, pourraient participer à la transmission du virus alors que considérés comme indemnes de virus au vu d’un résultat négatif au test PCR par écouvillonnage nasal.

Parmi les quatre patients étudiés, trois étaient porteurs d’une charge virale élevée dans la muqueuse olfactive (entre 0,1 et 0,4 million de copies d’ARN viral par microlitre). De même, la présence dans l’épithélium olfactif de la nucléoprotéine du SARS-CoV-2 a été détectée par immunofluorescence chez trois patients sur quatre.

Enfin, de nombreuses cellules immunitaires ont été observées dans la muqueuse olfactive chez chacun de ces patients. Des taux élevés en interleukine-6 (IL-6) ont été enregistrés chez ces patients présentant une anosmie prolongée ou persistante, à l’instar des premiers patients qui avaient présenté une perte d’odorat lors de l’infection virale aiguë et de ce qui avait été observé chez les hamsters expérimentalement infectés par le SARS-CoV-2.

Ces données montrent que « le neuroépithélium olfactif de patients présentant une perte de l’odorat persistante reste inflammatoire et infecté, avec persistance de l’ARN du SARS-CoV-2 chez chacun d’entre eux », déclarent les chercheurs.

Potentiel neuroinvasif du SARS-CoV-2

Ces travaux ne sont pas sans rappeler que de l’ARN viral ou des protéines du SARS-CoV-2 ont déjà été détectés dans le cerveau et/ou le liquide céphalo-rachidien, à l’autopsie de patients décédés de la Covid-19, par des chercheurs allemands en juin 2020 dans un article posté sur bioXriv (preprint) ainsi que par une équipe américaine en août dans le New England Journal of Medicine.

La question du potentiel neuroinvasif du SARS-CoV-2 est donc une nouvelle fois posée, même si d’autres mécanismes physiopathologiques ont déjà été évoqués (transport par voie rétrograde via les neurones sensoriels olfactifs et/ou via le nerf vague jusque dans le système nerveux central, atteinte de la barrière hémato-encéphalique à l’interface entre sang et cerveau, infiltration intracérébrale de cellules immunitaires infectées (lymphocytes T et/ou macrophages périphériques).

Cette nouvelle étude relance donc le débat sur un transport rétrograde du SARS-CoV-2 dans le système nerveux central à partir des voies nerveuses olfactives chez l’homme. Elle montre surtout qu’un trouble de l’odorat persistant pendant plusieurs mois chez des patients Covid-19 pourrait traduire la présence prolongée du virus dans le neuroépithélium olfactif, et donc une infection virale persistante de ce microenvironnement particulier. Nul doute que des études sur un nombre plus important de patients Covid-19 présentant une anosmie persistante devraient suivre.

Marc Gozlan (Suivez-moi sur Twitter, sur Facebook

* La technique RT-qPCR permet de faire une PCR quantitative à partir d’un échantillon d’ARN, la détection d’un signal positif étant révélée par un composé fluorescent qui se lie à l’ARN.

Pour en savoir plus :

Dias DE Mel G, Lazarini F, Levallois S, et al. COVID-19-associated olfactory dysfunction reveals SARS-CoV-2 neuroinvasion and persistence in the olfactory system. bioRxiv. Posted November 18, 2020. doi:10.1101/2020.11.18.388819

Puelles VG, Lütgehetmann M, Lindenmeyer MT, et al. Multiorgan and Renal Tropism of SARS-CoV-2. N Engl J Med. 2020 Aug 6;383(6):590-592. doi: 10.1056/NEJMc2011400

Meinhardt J, Radke J, Dittmayer C, et al. Olfactory transmucosal SARS-CoV-2 invasion as port of Central Nervous System entry in COVID-19 patients. bioRxiv. Posted June 04, 2020. doi: 10.1101/2020.06.04.135012

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Source: Covid-19 et perte d’odorat : du nouveau sur la persistance du SARS-CoV-2 et son potentiel neuroinvasif – Réalités Biomédicales